Aufbereitung von Nabelschnurblut zur Einlagerung

Was ist unter einer Separation mononukläerer Zellen (MNC) zu verstehen?

Einige private Banken frieren das Nabelschnurblut als Vollblutpräparat ein, während die meisten es aufarbeiten. Dabei gibt zwei Arten der Aufbereitung: die Volumenreduktion und die Separation.

Die Volumenreduktion kann sowohl durch Sedimentation als auch Zentrifugation bewerkstelligt werden. (Hinweis: Zur Sedimentation wird die Chemikalie "Hespan Starch" oder "Hetastarch" genutzt, die von Dupont Pharmaceuticals hergestellt wird.) Anschliessend werden die Blutbestandteile so getrennt, dass sich die roten Blutzellen unten und das Plasma (eine klare weisse Flüssigkeit) oben befinden. In der Mitte sammelt sich eine blassrosa farbene Schicht, die man "buffy coat" nennt. Diese enthält die weissen Blutzellen einschliesslich der Stammzellen. An diesem Punkt genügt eine sanfte Zentrifugation, um die weissen Blutzellen zu isolieren. Die meisten öffentlichen Nabelschnurblutbanken beenden die Aufbereitung an dieser Stelle und lagern die weissen Blutzellen im Beuteln ein.

Die Separation der mononukläeren Zellen (Zellen mit einem Zellkern, englisch: mononuclear cells - MNC) ist mit einer weiteren Zentrifugation zur Abtrennung der weissen Blutzellen verbunden. Eines der routinemässig von Stammzellforschern dazu verwendeten Verfahren ist die so genannte "Ficoll-Hypaque" Dichtegradienten-Zentrifugation. Dieser Separationsschritt reduziert das Volumen des Präparates auf lediglich ein paar Milliliter, die eine Lagerung in Röhrchen ermöglichen.

Mononukläere Zellen (MNC) Blutbildende (hämatopoetische) Stammzellen werden durch ein charakteristisches Oberflächenmolekül namens "CD34+" identifiziert, aber nur 1-2% der MNC sind tatsächlich Stammzellen. Wenn Eltern Nabelschnurblut einlagern, erhalten sie einen nachfolgenden Laborbericht, in dem von so und so vielen Milliarden gelagerten Zellen die Rede ist. Damit meint das Labor dann MNC und nicht Stammzellen. Das ist die Standardvorgehensweise in der Medizin.

Wo liegt das Pro und Kontra einer Separation mononukläerer Zellen (MNC)?

Finanzielles Kontra: Warum die Schererei?
Der gesunde Menschenverstand sagt, es gibt keinen Grund ein Präparat zu bearbeiten, wenn man nicht weiß, ob es je benötigt wird. Die Separation von MNC erhöht die Aufbereitungskosten im Labor, und diese Kosten werden an den Kunden weitergegeben.

Finanzielles Pro: Geringere Lagerkosten

• Je kleiner das Volumen des Präparats letztendlich ist, desto weniger flüssiger Stickstoff wird für die Konservierung benötigt.
• Sehr amüsant in diesem Zusammenhang ist, dass diese Banken, die zum Schluss kleinere Volumen haben, die Ersparnisse nicht an den Kunden weitergeben. Sie berechnen die Lagergebühr, die der Markt derzeit hergibt!

Medizinisches Pro: Vorteile des Abtrennens roter Blutzellen

• Das minimiert die Reaktion des Patienten im Fall einer abweichenden Blutgruppe vom Spender. (Merkwürdig aber wahr: Zwei Menschen können übereinstimmende Gewebemerkmale, d.h. HLA-Merkmale, haben, jedoch unterschiedliche Blutgruppen.)
• Außerdem, scheint das Kryoprotektivum (Gefrierschutzmittel) (siehe unten), das vor dem Einfrieren hinzugegeben wird, rote Zellen zu zerstören. Daher müssten die Stammzellen, wenn sie zu Transplantationszwecken aufgetaut werden, gewaschen werden, um das Kryoprotektivum und das aus den zerstörten roten Blutzellen freigesetzte Hämoglobin (das für Nieren toxisch ist) zu entfernen.
• In Anbetracht dessen werden einige Banken damit werben, einen sehr niedrigen "abschließenden Hämatokrit-Wert" zu haben, der auf der Zahl roter Zellen nach der Aufbereitung beruht.

Medizinisches Gegenargument: Rote Blutzellen müssen nicht entfernt werden

Nabelschnurblut-Transplantate sind weniger sensitiv für Blutgruppen-Unverträglichkeiten als Knochenmark-Transplantate. Bei den ersten Nabelschnurblut-Transplantaten wurde Vollblut verwendet. Trotzdem ist es in den USA inzwischen zur medizinischen Standardpraxis geworden, rote Blutzellen vor dem Einfrieren zu entfernen.

Referenzen:

• Gluckman E et al., 1989, N Engl J Med. 321(17):1174-1178
  "Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi´s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling"
  Das war das erste NSB-Transplantat nach einer Chemotherapie.
• Wagner, JE et al., 1995, Lancet, 346(8969):214-219
  "Allogeneic sibling umbilical-cord-blood transplantation in children with malignant and non-malignant disease."
  Report über 44 NSB-Transplantate; mindestens 28 davon waren unmanipuliertes NSB (Vollblut)
• Hahn, t, et al., 2003, Bone Marrow Transplant 32(2):145-50
  "Use of nonvolume-reduced (unmanipulated after thawing) umbilical cord blood stem cells for allogeneic transplantation results in safe engraftment"
  Vergleicht 18 unmanipulierte Transplantate mit 8 volumenreduzierten.

Medizinische Frage: Gehen Stammzellen während der Aufbereitung verloren?
Es ist unvermeidlich, dass einige Stammzellen beim Prozess des Abschöpfens des Buffy Coats oder der Separation der MNC verloren gehen. Es wird jedoch heiss debattiert, welche Fraktion an Stammzellen verloren geht. Jeder behauptet gern, dass seine Aufbereitungsmethode die beste ist, da er weniger Zellen verliert. -- ABER -- Studien in der medizinischen Literatur (siehe unten) finden keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit (Viabilität) der Zellen bei bearbeitetem und unbearbeitetem Nabelschnurblut. Es gibt einen weiten Schwankungsbereich, etwa 20%, beim Messen der wiederaufgefundenen lebensfähigen Stammzellen. Und diese Schwankung übersteigt die Differenz zwischen den verschiedenen Methoden der Aufbereitung.

Referenzen:

• Rubinstein P, et al., 1995 , Proc Natl Acad Sci USA 92(22):10119-22
  "Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution."
  Berichtet von "fast vollständiger Wiederfindung" lebensfähiger hämatopoetischer Vorläuferzellen nach Volumenreduktion, Einfrieren und Auftauen.
• Sato, J, et al., 1995 , Stem Cells 13(5):548-55
  "Quantitative and qualitative comparative analysis of gradient-separated hematopoietic cells from cord blood and chemotherapy-mobilized peripheral blood."
  Nach Ficoll-Dichtegradienten-Separation von NSB waren die Wiederfindungsraten von MNC und CD34+ Zellen jeweils 55% und 107% (eine Wiederfindung von mehr als 100% deutet an, dass das Experiment nicht sehr genau war -- Der Redakteur)
• Kletzel, M. et al., 1997, J. Hematotherapy, 6(3):269-272
  "Red cell depletion of umbilical cord blood (UCB): comparison between unmanipulated and red cell-depleted UCB by Ficoll-Paque density gradient separation."
  Diese Studie fand keinen signifikanten Unterschied zwischen separiertem und unmanipuliertem NSB in Bezug auf die Lebensfähigkeit und Wiederfindung der MNC.
• Eichler H, et al., 2001, Z Geburtshilfe Neonatol. 205(6):218-23
  "Aspects of donation and processing of stem cell transplants from umbilical cord blood"
  (Bericht der Mannheimer öffentlichen NSB-Bank; Artikel in Deutsch)
  Erzielte eine durchschnittliche Wiederfindung bei MNC von 93,4% nach der Aufbereitung mit der Buffy Coat-Methode.
• Fietz T, et al., 2002, J Hematother Stem Cell Res 11(2):429-35
  "Flow cytometric CD34+ determination in stem cell transplantation: before or after cryopreservation of grafts?"
  Die durchschnittliche Wiederauffindung war 93,7% (SD +/- 23,1) bei allen lebensfähigen Zellen und 100% (SD +/- 22,3) bei den lebensfähigen CD34+ Zellen. "Daher sollten Daten zu CD34-Zellen von unterschiedliche Laboren, zum Beispiel innerhalb multizentrischer Studien, vergleichbar sein, unabhängig von den verschiedenen Zeitpunkten, zu denen sie gewonnen werden."
• Timeus F, et al., 2003, Haematologica 88(1):74-9
  "Recovery of cord blood hematopoietic progenitors after successive freezing and thawing procedures."
  Die meisten NSB-Präparate der Welt sind in Einzelbeuteln eingelagert. Ist es machbar, den gesamten Beutel aufzutauen, das Blut in zwei Portionen zu teilen, eine zu nutzen und die andere wieder einzufrieren? Die Autoren fanden eine Lebensfähigkeit der Zellen bezogen auf die Basiswerte nach dem ersten Auftauen, die erst nach dem dritten Wiederauftauen signifikant sank.

Was ist ein Kryoprotektivum (Gefrierschutzmittel)?

Wenn lebende Gewebe und Zellen eingefroren werden, dann versetzt man sie mit einem Mittel, das sie vor der Bildung von Eiskristallen schützt, die die Zellmembran zerstören würden. Das am häufigsten für das Einfrieren von Nabelschnurblut genutzte Gefrierschutzmittel ist "DMSO" (DiMethylSulfOxid, gewöhnlich mit 10% Volumenprozent zugegeben). Allerdings gibt es sehr VIEL Forschung in der medizinischen Literatur zu alternativen chemischen Kombinationen. Da sich jedoch kein Konsens abzeichnet, werden diese Artikel hier nicht angeführt.

• Einige öffentliche Banken mit großen Budgets benutzen "BioArchive" Freezer der Firma Thermogenesis (Nasdaq: KOOL). Diese Freezer waren ursprünglich im New York Blood Center entwickelt worden. Dieser Freezer, der mit flüssigem Stickstoff arbeitet, nutzt ein spezielles, computergesteuertes Robotersystem, um bis zu 3.626 Beutel einzufrieren und einzulagern. Die Ablage und Bereitstellung der Präparate erfolgt automatisiert. Das Ziel bei der Verwendung von Roboterarmen beim Weiterreichen und Bereitstellen von Präparaten ist die Vermeidung von "Transient Warming Events (TWEs = vorübergehende Erwärmungen)", wenn bei der Lagerung Präparate hinzugegeben oder entfernt werden.

• Die meisten öffentlichen NSB-Banken in den USA nutzen Spezialtanks, die grundsätzlich isolierte Tanks mit Deckeln sind. Der Nachteil dieser Einheiten besteht darin, dass der Deckel geöffnet werden muss, wenn Präparate hinzugefügt oder entfernt werden. Allerdings wird die Temperatur ständig überwacht und sie haben sich als effektiv für die Langzeitlagerung erwiesen.

• Alle privaten NSB-Banken in den USA benutzen wie die meisten öffentlichen Banken ebenfalls Spezialtanks.

Fotos von Lagertanks

(Bergen) Community Blood Services	Cord Blood Registry

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